Práctica - nitrógeno proteina

DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL Y PROTEÍNA

Para la determinación de la proteína bruta se sigue el procedimiento de Kjeldahl, descrito en el método 955.04 de la AOAC (1990), utilizando una unidad de digestión y una de destilación Kjeldahl. El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en acido bórico formándose borato de amonio que se valora con ácido clorhídrico.

Reactivos y material

• Tubos de digestión y destilación Kjeldahl y matraces Erlenmeyer.
• Probetas
• H₂SO₄ concentrado (densidad: 1.84 a 20ºC)
• NaOH al 38% (v/v)
• Solución de H₃BO₃ al 4% (p/v)
• HCl 0.1N.
• Catalizador: mezcla de Se/CuSO₄.5H₂0/4K_{2SO4, en proporciones de 1/1.25/14.42 (p/p/p), respectivamente o pastillas catalizadoras Kjeldahl.}
• Indicador mixto: 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de metileno disueltos en 1000 mL de alcohol etílico del 96%.

Procedimiento

• Se pesan en un tubo de digestión Kjeldahl entre 0.5 a 5 g de alimento, dependiendo de si es un harina o un alimento con alto contenido en humedad, a la cual se le adicionan 7 g de mezcla catalítica o una pastilla catalizadora, y 15 mL de ácido sulfúrico concentrado.
•  Los tubos se colocan a continuación en un bloque calefactor, realizando una digestión en etapas y elevando poco a poco la temperatura, hasta alcanzar los 450°C, temperatura a la que debe mantener durante un tiempo mínimo de 45, hasta obtener una solución completamente transparente que puede tener una coloración verdosa.
• Una vez que los tubos se colocan en la unidad de digestión se coloca el extractor de gases conectado a una unidad de neutralización.
• Una vez completada la digestión se deja enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente, para pasar a la fase de destilación.
• El destilador se debe calentar previamente con un tubo en vacio o con un poco de agua destilada para que se produzca de modo adecuado la destilación de las muestras.
• Prepara un matraz Erlenmeyer con 25 ml de solución de ácido bórico y 3-4 gotas de indicador.
• Posteriormente se lleva el tubo con la muestra digerida a la unidad de destilación, neutralizando inicialmente la muestra con NaOH al 38% (que se dosifica automáticamente) y se destila la mezcla, arrastrando así los iones amonio hacia una solución de ácido bórico al 4% (p/v) que inicialmente es de color rojizo y que al recoger los iones amonio vira a  color verde, como consecuencia del cambio de pH. El proceso finaliza cuando se obtienen aproximadamente 150 mL de destilado.
• Posteriormente se procede a realizar una valoración del destilado con HCl 0.1N, para determinar la cantidad de amoniaco absorbido por el ácido bórico.

Para el cálculo de la proteína bruta se utiliza la siguiente expresión:

donde V₁ es el volumen (mL) de la solución de HCl requerido para la prueba del blanco, V₂ es el volumen (mL) de solución de HCl requerido para la muestra problema, N la normalidad de la solución de HCl utilizado en este caso 0.1, y P es el peso en gramos de la muestra. F es el factor de conversión relacionado con la cantidad de nitrógeno contenido en los aminoácidos de las proteínas y varía según el tipo de alimento utilizándose los siguientes valores:

6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y proteínas en general
5.7: para cereales y derivados de soya
6.38: leche y productos lácteos
5.55: gelatina
5.95: arroz